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Revista del Hospital Psiquiátrico
de La Habana
Volumen 19 | Nº 1 | Año 2022 ISSN: 0138-7103 | RNPS: 2030
Artículo original
Efecto de un extracto de Azadirachta indica en el aprendizaje
y memoria espacial en Rattus rattus
Effect of Azadirachta extract on learning and spatial memory
in Rattus rattus
Davis Alberto Mejía Pinedo
1
Juan Luis Rodríguez Vega
1
Jorge Luis Campos Reyna
1
Jose Elias Cabrejo Paredes
1
Miryam Griselda Lora Loza
1
1
Universidad Nacional de Trujillo, Escuela de Posgrado. Trujillo, Perú.
Recibido: 10/5/2022
Aceptado: 9/9/2022
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RESUMEN
Introducción: El neem es un fruto oriundo de la india que presenta en su composición
flavonoides, los cuales podrían facilitar estados de memoria y aprendizaje espacial en ratas
favorables de acuerdo a sus índices de aprendizaje.
Objetivo: Evaluar el efecto del extracto de Azadirachta indica sobre el aprendizaje y
memoria espacial en Rattus rattus
Métodos: Se desarrolló un diseño de estímulo creciente. Se ordenaron dos grupos
semejantes de cinco ratas, cada uno a escala piloto, agrupándose de acuerdo a la
concentración de dosis, a los que se les dio por vía oral el extracto a diferentes
concentraciones y el grupo testigo no se le dio tratamiento valorando el aprendizaje y
memoria espacial en el laberinto acuático de Morris.
Resultados: Las ratas que en línea base presentaron un comportamiento compatible con
aprendizaje y memoria espacial evidenciando un tiempo promedio similar para desarrollar
los tiempos de latencia de la fase de adquisición y en la fase de retención; al aplicar la
dosis de 200 y 400 mg/kg los índices de aprendizaje del piloto se movilizaron discretamente
a la derecha. Por lo tanto, se acortó el tiempo de latencia de la fase de adquisición, durante
la fase de retención se evidenció un desarrollo de la memoria según el índice de aprendizaje.
Conclusiones: El tratamiento in vivo con el extracto de Azadirachta indica ha presentado
un efecto positivo en los sujetos experimentales a nivel de la duración de la conducta
motora en el laberinto acuático de Morris, logrando índices de aprendizaje pertinentes.
Palabras clave: aprendizaje; memoria espacial; extracto de neem.
ABSTRACT
Introduction: Neem is a fruit native to India that presents flavonoids in its composition,
which could facilitate favorable memory and spatial learning states in rats according to
their learning indices.
Objective: To evaluate the effect of Azadirachta indica extract on learning and spatial
memory in Rattus rattus.
Methods: An increasing stimulus design was developed. Two similar groups of five rats were
arranged, each at pilot scale, grouped according to the dose concentration, which were
given the extract orally at different concentrations and the control group was not treated,
assessing learning and spatial memory in the Morris water maze.
Results: The rats that in baseline presented a behavior compatible with learning and spatial
memory evidencing a similar average time to develop the latency times of the acquisition
phase and in the retention phase; when applying the doses of 200 and 400 mg/kg the
learning rates of the pilot moved discreetly to the right. Therefore, the latency time of the
acquisition phase was shortened, during the retention phase a memory development
according to the learning index was evidenced.
Conclusions: The in vivo treatment with Azadirachta indica extract has presented a
positive effect on the experimental subjects at the level of the duration of motor behavior
in the Morris water maze, achieving relevant learning indexes.
Keywords: learning; spatial memory; neem extract.
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Introducción
El aprendizaje es el proceso mediante el cual un organismo cambia su comportamiento
para adaptarse a los cambios en el entorno circundante y las condiciones impredecibles.
Junto con el poder selectivo de la evolución, el aprendizaje constituye el principal
método de adaptación biológica.
(1)
Cuanto más cambia el entorno, más plasticidad debe
ser la conducta, por lo que los organismos que viven en diferentes entornos también
exhiben diferentes grados de plasticidad conductual. Esta plasticidad a su vez refleja la
plasticidad de las neuronas y el sistema nervioso que caracterizan al organismo. Cuanto
mayor sea la plasticidad del sistema nervioso, mayor será la posibilidad de aprender en
los animales. Por tanto, el aprendizaje puede considerarse como un cambio en el
sistema nervioso, que es provocado por la experiencia y conduce a cambios duraderos
en el comportamiento del organismo.
(2)
Las plantas medicinales siempre han sido una fuente de sustancias farmacológicamente
activas de importancia terapéutica y constituyen una parte de la medicina tradicional y
moderna, alimentos y productos nutracéuticos.
(3)
En 2005, la Organización Mundial de
la Salud (OMS) señaló que más del 80 % de la población mundial depende de las plantas
medicinales para resolver problemas de salud en la atención primaria y recomendó más
investigaciones en este campo, especialmente en el tratamiento de enfermedades
crónicas.
(4)
Desde 1948 las propiedades antiinflamatorias de la hesperidina, la naringina
y la nobitina han estado presentes en los componentes solubles en agua de casi todas
las especies de cítricos. Desde entonces, muchos estudios in vivo e in vitro han descrito
las propiedades antiinflamatorias de los flavonoides.
(5,6,7)
Además de sus propiedades
antiinflamatorias, se describen los diversos efectos de estos metabolitos, pero no
mencionan su impacto en el sistema nervioso central y por añadidura en la memoria y
aprendizaje, lo cual está en pleno estudio y se comentará a continuación.
(8)
El neem, cuyo nombre científico es Azadirachta indica, es una planta que presenta un
alto contenido de principios activos, los que le facultan para ser utilizada como agente
terapéutico para diferentes enfermedades, hecho conocido desde antaño. Es una de las
antiguas plantas hindúes de las que se han descubierto sus propiedades y usos
peculiares.
(9)
El neem presenta uso tradicional, sus propiedades fueron descritas en
sánscrito antiguo durante 4000 años.
(10)
En la India, el neem se llama "farmacia de aldea" debido a sus múltiples usos para tratar
diversas enfermedades.
(11)
Las hojas, semillas, flores y aceites de los árboles tienen
efectos analgésicos, repelentes, antipiréticos, antisépticos, astringentes, calmantes,
diuréticos, promotores de la piel, hidratantes y laxantes. Se ha demostrado que el
extracto de Azadirachta indica, tiene propiedades antibacterianas, antidiabéticas,
antifúngicas y antivirales.
(12)
Existen compuestos especiales en su estructura, como los
terpenoides o más específicamente limonoides, kaempferol, estos compuestos están
constituidos principalmente por cobre, hidrógeno y oxígeno. La presencia de oxígeno
hace que estos compuestos presenten mayor solubilidad en agua, metanol o etanol, que
el hexano.
(13,14,15)
La limonina es producida por especies de la familia Rutaceae. Son
compuestos estereoquímicos homogéneos cuya estructura típica se deriva del esqueleto
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esteroide 4,4,8-trimetil-17-furanilo como precursor, por ejemplo, e compuestos
limonoides, en forma de limón en el anillo D de C-17 tiene un anillo de furano.
(16,17,18)
No existen abundantes investigaciones sobre sus frutos. Este fruto podría tener
capacidad para mejorar el aprendizaje y la memoria espacial.
Métodos
En cuanto al diseño de estudio este fue de tipo experimental a estímulo creciente,
considerando los siguientes grupos de tratamiento,
(19,20,21)
con los grupos de ratas
distribuidos de la siguiente forma:
Control negativo: ratas sin extracto: 2
Experimento: tratamiento con extracto a dosis 200 mg/kg: 5
Tratamiento con extracto a dosis 400 mg/kg: 5
Después de los 14 días del periodo de cuarentena, al día 15 se administró por vía oral
utilizando una cánula al sujeto de experimentación, a las 8 de la mañana, 2 horas antes
del procedimiento en el laberinto acuático de Morris.
(22)
Muestra
El material de estudio zoológico consistió en 20 Rattus rattus, machos, de dos meses,
con peso corporal entre 150-200 gramos, adquiridos del Instituto Nacional de Salud,
Chorrillos, Lima, que se alojaron en un bioterio, con las condiciones convencionales de
aclimatación y manutención en el bioterio fueron de temperatura ambiente a 23 ºC,
humedad relativa de 88 %, con fotoperiodos de luz–obscuridad de 12 horas cada uno; la
alimentación balanceada estuvo dada a base de Purina
®
para roedores. Estos
especímenes fueron agrupados muestralmente según el método de Mead.
(23,24,25)
Procedimiento
Preparación del extracto
Se utilizó, el método descrito por Lecca y otros,
(24)
se seleccionaron los frutos de
Azadirachta indica según en buen estado, avalados y certificados por el Herbarium
Truxillensis HUT de la Universidad Nacional de Trujillo, Perú. El fruto fue lavado en
abundante agua para eliminar contaminantes. Se procedió en el laboratorio con 870 g
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obtenidos del fruto. El cual se disolvió en 16 litros de agua, luego se filtró sobre papel
de algodón y se congeló a -20 ºC durante 24 horas para obtener un material en estado
sólido. Utilizando un liofilizador de 4,5 L, el extracto de agua congelada se deshidrató
por sublimación a baja temperatura y presión de vapor (-40 ºC y 1,33 x 10
-3
MBARR) esto
durante 72 horas. Se pesó el producto con una balanza analítica y se almacenó en un
frasco cerrado y protegido de la luz en un ambiente seco por debajo de los 25 ºC.
(26)
Evaluación de la memoria espacial
Para el proceso de evaluación se empleó el laberinto acuático de Morris que es una
piscina circular de 120 cm de diámetro y 56 cm de altura, la cual fue llenada con agua
a temperatura fría (17-19 ºC), esta se dividió en cuatro cuadrantes imaginarios donde
en la zona media del cuadrante noreste se sumerge una plataforma de 19 cm de altura
y 12 cm de diámetro; considerando esta posición como la salida del laberinto acuático
de Morris. Es aquí donde se logró valorar dos fases:
A. Fase de adquisición del aprendizaje (en esta fase se mantiene la plataforma y se
asignan claves visuales: cruz y aspa)
a. Se introduce al animal con el hocico orientado a las paredes del cilindro,
diariamente se le coloca en el agua en un cuadrante diferente excepto en
el cuadrante noreste, de esta manera se consigue que el animal logre
encontrar la plataforma empleando para esto las claves visuales, mas no
vías de carácter directo: luego se le deja en natación libre por 180 s (2
min, aproximadamente)
b. Trascurrido los 180 s, si el animal no hubiera logrado hallar la plataforma,
el experimentador le muestra la plataforma y deja que el animal
permanezca en ella unos 15 segundos antes de realizar el próximo intento.
Se repite este ensayo como máximo dos oportunidades de 180 s cada una,
hasta que logre encontrar la plataforma. Se considera por concluido el
ensayo del día si el animal hace el test antes de tiempo o si no encuentra
la plataforma en dos oportunidades.
c. Se tomó también como criterio si en cada uno de los tres ensayos de
adquisición, al registrar el tiempo de latencia de escape (encontrar la
plataforma de escape) el animal logra encontrar la plataforma antes de
los 180 s. El tiempo se considera igual a cero segundos en el resto de
ensayos que aún queden por realizar.
B. Fase de retención o memoria (en este test las claves visuales están presentes: la
cruz y el aspa; mas no está presente la plataforma). Esta fase se aplicó tres días
después y tres meses después.
a. En este ensayo carácter único se dejó en natación al animal por 60 s. Se
tomó el tiempo que la rata permanecía en el cuadrante noreste, donde en
los ensayos de adquisición estuvo la plataforma de salida (tiempo de
permanencia).
b. Es catalogado el tiempo máximo de 120 s para esta fase de retención.
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El índice de aprendizaje
En el experimento se consideraron dos etapas: de adquisición (EA) y de recuperación
(ER). Se calculó el índice de aprendizaje (IAP) de acuerdo con la ecuación de Davolio y
otros como:
(25)
Donde:
TE es el tiempo empleado
𝐼𝐴𝑃 = 1 −
𝑇𝐸
𝑇𝑀
(1)
TM es el tiempo máximo permitido: 180 s para la EA y 120 s para la ER.
Se consideró:
Aprendizaje pobre: 0 ≤ IAP < 0,4
Aprendizaje regular: 0,4 ≤ IAP < 0,6
Aprendizaje bueno: 0,6 ≤ IAP < 0,8
Aprendizaje excelente: 0,8 ≤ IAP ≤ 1
Análisis estadístico
Se emplearon métricas descriptivas para lo cual se utilizó un aplicativo en Microsoft
Excel. La evaluación de los resultados obtenidos se comparó los respectivos índices de
aprendizaje. Para evaluar los resultados obtenidos mediante la prueba de significancia
DMS de la diferencia de medias. Se realizó una prueba complementaria de Tukey,
además se aplicó la prueba análisis de la varianza (ANOVA) de un factor para los grupos.
En esta prueba se obtuvieron valores de F
o
de 376,33 que es el valor calculado y un valor
F
t
de 8,85 que representa el valor tabular para cuando está presente una probabilidad
de error de p < 0,05. Estos valores se compararon posteriormente en la prueba
estadística desarrollada.
Aspectos éticos
Para referirse a la ética de investigación con animales de laboratorio, se tuvo en cuenta
los principios éticos de las tres R de Russel (reemplazo, reducción y refinamiento).
Asimismo, se consideró la Ley 30407 “Ley de protección y bienestar animal”.
(26)
También
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los criterios elementales de la American Veterinary Association para el tratamiento de
mamíferos pequeños en experimento
(27,28,29,30)
. Además, se emplearon las normas éticas
de la experimentación animal de la Guía de Manejo y Cuidado de los Animales propuesta
por el Ministerio de Salud del Perú para la optimización de un medio adecuado y libre
de peligros, así como una adecuada calidad de vida.
(29-31)
Resultados
En la tabla 1 se resumen los resultados de aprendizaje a nivel de línea base y
experimento piloto según los tiempos de latencia del aprendizaje. Se evidenció menores
tiempos según avanzan del 1.º al 3.
er
día en el desplazamiento del laberinto acuático de
Morris, y según la concentración de dosis de 200 a 400 mg/kg de peso el tiempo de
ejecución es menor. Al 7.º día, o día 4 y 5 de prueba en la fase de retención, se encontró
una similitud con el tiempo desarrollado en el día 1, lo cual se valora al aplicar los
índices de aprendizaje.
Tabla 1 - Tiempos de latencia de aprendizaje en las fases de adquisición y de retención
Grupos
Promedio de la Fase de adquisición
Promedio de la Fase de retención
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
(Día 7)
Día 5
(3 meses después)
Control
29
30
33
32
33
Tratamiento dosis 200
30
29
29
29
30
Tratamiento dosis 400
32
28
26
30
28
La tabla 2 expresa el puntaje corregido a índices de aprendizaje según la fórmula de
Davolio. Se apreciaroníndices de aprendizaje excelentes de acuerdo a la dosis empleada
cuyas unidades de probabilidad se aproximan a niveles altos de aprendizaje excelente,
y mantienen un aprendizaje bueno con tendencia alta en la fase de retención (Fig. 1).
Tabla 2 - Índices de aprendizaje durante las fases de adquisición y de retención
Promedio de la Fase de adquisición
Promedio de la Fase de retención
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
(Día 7)
Día 5
(3 meses después)
0,83
0,83
0,82
0,82
0,79
0,83
0,83
0,83
0,83
0,80
0,82
0,84
0,85
0,83
0,84
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Fig. 1 - Tiempos de latencia de aprendizaje en las fases de adquisición y de retención
disponibles en repositorio de unitru.edu.pe
Discusión
Los flavonoides se atribuyen a sus propiedades antioxidantes, principalmente porque su
estructura química les da el potencial permanecer en el tejido buen tiempo, por lo que
la actividad antioxidante puede ser causada por su capacidad reductora. Se han descrito
algunos flavonoides con actividad en la memoria y una participación activa en
mecanismos relacionados con el aprendizaje.
En este estudio se postula que el limoneno presente en el neem podría tener un
mecanismo neurotrófico pertinente para el desarrollo, crecimiento y función de las
neuronas. Siguiendo estudios que señalan que algunos flavonoides regresionan la
pérdida de memoria inducida por β-amiloide en modelos animales tipo ratón,
(8)
se
postula que existe una interacción selectiva del flavonoide con dos proteínas quinasas:
proteína quinasa activada por nitrógenos (MAPK) (relacionada con el crecimiento
celular) y proteína de unión al elemento de reconocimiento de AMPc (CREB) (una
proteína de transcripción), su activación conduce al crecimiento de nuevas conexiones
sinápticas, proporcionando así un estado de memoria estable a largo plazo.
En 2007, un equipo de investigación demostró que el flavonoide nobitina interactúa con
el sistema glutamatérgico (especialmente los receptores AMPA) y ejerce un efecto
directo sobre la memoria.
(28,29)
Por otro lado, es necesario recordar que, desde la década
de 1960, los ansiolíticos más utilizados en la práctica clínica han sido las
benzodiazepinas (BDZ), que se utilizan para tratar la epilepsia, el insomnio,
determinadas depresiones, algunos estados emocionales, etc. Las benzodiazepinas
presentan una interacción con los receptores GABAérgicos de tipo A.
(12,13)
Estos
receptores son proteínas transmembrana ensambladas por heterooligómeros, porque
están compuestos por varias subunidades, que constituyen canales iónicos que pueden
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permear iones cloruro (Cl
-
), y sus ligandos son grupos γ-amino Ácido butírico (GABA).
Cuando el GABA se une al receptor, el canal de iones se abre, permitiendo el flujo de
iones de cloruro, hiperpolarizando así la membrana de la neurona receptora e inhibiendo
la transmisión de impulsos nerviosos, lo que resulta en un efecto calmante.
En la década de 1980, Paladini
(14)
observó una estructura similar, afinidad y reacción
farmacológica entre BDZ y flavonoides. Se han publicado innumerables artículos
científicos sobre estudios in vivo e in vitro para describir los efectos farmacológicos de
la síntesis de flavonoides naturales y sintéticos, así como estudios teóricos de cálculos
ab initio para establecer un modelo de interacción ligando-receptor (flavonoide-
receptor GABA-A) que correlacione la estructura y propiedades fisicoquímicas de estos
compuestos con afinidad por diferentes sitios receptores y las reacciones farmacológicas
y de comportamiento posteriores. En estos estudios, se logró diseñar un modelo
farmacóforo que describe las condiciones mínimas necesarias para la unión efectiva
específica de flavonoides al sitio flavonoide (FS) del receptor (igual que BDZ) GABA. En
este modelo, el grupo carbonilo del flavonoide solo interactúa con el sitio bifuncional
H2 / A3, y el anillo B está ubicado cerca de la región lipofílica de L2. El anillo A en los
flavonoides se superpone con el anillo 5-fenilo de diazepam; no hay interacción entre
los flavonoides y el sitio H1, y no hay posibilidad de interacción con A2; lo cual cumpliría
para el caso del limoneno presente en el neem. Esto sería el modelo explicativo de su
actividad en la memoria y el aprendizaje espacial, un modelo desarrollado teniendo en
cuenta la bioética.
(30,31)
Se concluye, que el tratamiento in vivo con el extracto de Azadirachta indica tiene un
efecto positivo sobre los índices de aprendizaje que se manifiesta en la duración de la
conducta motora en los animales de experimentación.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Universidad Nacional de Trujillo y la Escuela de Postgrado
por las facilidades brindadas para la implementación del presente trabajo.
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https://raco.cat/index.php/rcda/article/view/318482
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no tienen conflicto de intereses.
Contribuciones de los autores
Davis Alberto Mejía Pinedo: análisis formal, curaduría de datos, metodología.
Juan Luis Rodriguez Vega: conceptualización, análisis formal, metodología.
Este material es publicado según los términos de la Licencia Creative Commons Atribución–NoComercial 4.0. Se permite el uso,
distribución y reproducción no comerciales y sin restricciones en cualquier medio, siempre que sea debidamente citada la fuente
primaria de publicación.
Jorge Luis Campos Reyna: análisis formal, curaduría de datos, metodología.
José Elías Cabrejo Paredes: análisis formal, curaduría de datos, metodología.
Miryam Griselda Lora Loza: análisis formal, curaduría de datos, metodología.